தயாரிப்புகள்
2019-nCoV-க்கான Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR கண்டறிதல் கருவி
எதிர்பார்க்கப்படும் பயன்பாடு
இந்த கருவி, தொண்டை ஸ்வாப்கள், நாசோபார்னீஜியல் ஸ்வாப்கள், மூச்சுக்குழாய் அழற்சி திரவம், சளி ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி புதிய கொரோனா வைரஸை (2019-nCoV) தரமான முறையில் கண்டறிவதற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இந்த தயாரிப்பின் கண்டறிதல் முடிவு மருத்துவ குறிப்புக்காக மட்டுமே, மேலும் மருத்துவ நோயறிதல் மற்றும் சிகிச்சைக்கான ஒரே சான்றாக இதைப் பயன்படுத்தக்கூடாது. நோயாளியின் மருத்துவ வெளிப்பாடுகள் மற்றும் பிற ஆய்வக சோதனைகளுடன் இணைந்து, நிலையின் விரிவான பகுப்பாய்வு பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
ஆய்வுக் கொள்கை
இந்த கருவி ஒரு-படி RT- PCR தொழில்நுட்பத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டது. உண்மையில், 2019 புதிய கொரோனா வைரஸ் (2019-nCoV) ORF1ab மற்றும் N மரபணுக்கள் பெருக்க இலக்கு பகுதிகளாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் மற்றும் ஃப்ளோரசன்ட் ஆய்வுகள் (N மரபணு ஆய்வுகள் FAM உடன் பெயரிடப்பட்டுள்ளன மற்றும் ORF1ab ஆய்வுகள் HEX உடன் பெயரிடப்பட்டுள்ளன) மாதிரிகளில் 2019 புதிய வகை கொரோனா வைரஸ் RNA ஐக் கண்டறிய வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளன. மாதிரி சேகரிப்பு, RNA மற்றும் PCR பெருக்கத்தின் செயல்முறையைக் கண்காணிக்க, தவறான எதிர்மறை முடிவுகளைக் குறைக்க, இந்த கருவியில் ஒரு எண்டோஜெனஸ் உள் கட்டுப்பாட்டு கண்டறிதல் அமைப்பு (CY5 உடன் பெயரிடப்பட்ட உள் கட்டுப்பாட்டு மரபணு ஆய்வு) உள்ளது.
முக்கிய கூறுகள்
| கூறுகள் | தொகுதி()48T/கிட்) |
| RT-PCR எதிர்வினை தீர்வு | 96µலி |
| nCOV ப்ரைமர் TaqMan probexture (ORF1ab,N ஜீன்,RnaseP ஜீன்) | 864µலி |
| எதிர்மறை கட்டுப்பாடு | 1500μl (மி.லி) |
| nCOV நேர்மறை கட்டுப்பாடு (l ORF1ab N ஜீன்) | 1500μl (மி.லி) |
சொந்த வினையூக்கிகள்: RNA பிரித்தெடுத்தல் அல்லது சுத்திகரிப்பு வினையூக்கிகள். எதிர்மறை/நேர்மறை கட்டுப்பாடு: நேர்மறை கட்டுப்பாடு என்பது இலக்கு துண்டைக் கொண்ட RNA ஆகும், அதே நேரத்தில் எதிர்மறை கட்டுப்பாடு என்பது நியூக்ளிக் அமிலம் இல்லாத நீர் ஆகும். பயன்பாட்டின் போது, அவை பிரித்தெடுப்பதில் பங்கேற்க வேண்டும் மற்றும் தொற்றுநோயாகக் கருதப்பட வேண்டும். அவை தொடர்புடைய விதிமுறைகளின்படி கையாளப்பட்டு அப்புறப்படுத்தப்பட வேண்டும்.
உள் குறிப்பு மரபணு மனித RnaseP மரபணு ஆகும்.
சேமிப்பு நிலைமைகள் மற்றும் காலாவதி தேதி
-20±5℃, 5 முறைக்கு மேல் மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் உருகுவதைத் தவிர்க்கவும், 6 மாதங்களுக்கு செல்லுபடியாகும்.
பொருந்தக்கூடிய கருவி
FAM / HEX / CY5 மற்றும் பிற மல்டி-சேனல் ஃப்ளோரசன்ட் PCR கருவியுடன்.
மாதிரி தேவைகள்
1. பொருந்தக்கூடிய மாதிரி வகைகள்: தொண்டை துடைப்பான்கள், நாசோபார்னீஜியல் துடைப்பான்கள், மூச்சுக்குழாய் அழற்சி திரவம், சளி.
2. மாதிரி சேகரிப்பு (அசெப்டிக் நுட்பம்)
தொண்டைக் குழாயின் ஸ்வாப்: டான்சில்ஸ் மற்றும் பின்புற தொண்டைச் சுவரை ஒரே நேரத்தில் இரண்டு ஸ்வாப்களால் துடைத்து, பின்னர் மாதிரி கரைசலைக் கொண்ட சோதனைக் குழாயில் ஸ்வாப் தலையை மூழ்கடிக்கவும்.
சளி: நோயாளிக்கு ஆழ்ந்த இருமல் வந்த பிறகு, இருமல் சளியை மாதிரி கரைசல் கொண்ட ஒரு திருகு மூடி சோதனைக் குழாயில் சேகரிக்கவும்; மூச்சுக்குழாய் அழற்சி திரவம்: மருத்துவ நிபுணர்களால் மாதிரி எடுத்தல். 3. மாதிரிகளின் சேமிப்பு மற்றும் போக்குவரத்து.
வைரஸ் தனிமைப்படுத்தல் மற்றும் ஆர்.என்.ஏ சோதனைக்கான மாதிரிகள் விரைவில் சோதிக்கப்பட வேண்டும். 24 மணி நேரத்திற்குள் கண்டறியக்கூடிய மாதிரிகளை 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் சேமிக்கலாம்; 24 மணி நேரத்திற்குள் கண்டறிய முடியாதவை.
மணிநேரங்களை -70℃ அல்லது அதற்குக் கீழே சேமிக்க வேண்டும் (-70℃ சேமிப்பு நிலை இல்லை என்றால், அவை
தற்காலிகமாக -20℃ குளிர்சாதன பெட்டியில் சேமிக்கப்படும்). மாதிரிகள் போக்குவரத்தின் போது மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் உருகுவதைத் தவிர்க்க வேண்டும். மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்ட பிறகு விரைவில் ஆய்வகத்திற்கு அனுப்பப்பட வேண்டும். மாதிரிகள் நீண்ட தூரத்திற்கு கொண்டு செல்லப்பட வேண்டியிருந்தால், உலர் பனி சேமிப்பு பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
சோதனை முறைகள்
1 மாதிரி செயலாக்கம் மற்றும் RNA பிரித்தெடுத்தல் (மாதிரி செயலாக்க பகுதி)
ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுப்பதற்கு 200μl திரவ மாதிரியை எடுக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது. தொடர்புடைய பிரித்தெடுக்கும் படிகளுக்கு, வணிக ஆர்.என்.ஏ பிரித்தெடுக்கும் கருவிகளின் வழிமுறைகளைப் பார்க்கவும். எதிர்மறை மற்றும் எதிர்மறை இரண்டும்
இந்த தொகுப்பில் உள்ள கட்டுப்பாடுகள் பிரித்தெடுப்பதில் ஈடுபட்டன.
2 PCR வினைப்பொருள் தயாரிப்பு (வினைப்பொருள் தயாரிப்பு பகுதி)
2.1 கிட்டில் இருந்து அனைத்து கூறுகளையும் அகற்றி, அறை வெப்பநிலையில் கரைத்து கலக்கவும். பயன்பாட்டிற்கு முன் சில வினாடிகள் 8,000 rpm இல் மையவிலக்கு செய்யுங்கள்; தேவையான அளவு வினைப்பொருட்களைக் கணக்கிடுங்கள், பின்னர் எதிர்வினை அமைப்பு பின்வரும் அட்டவணையில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி தயாரிக்கப்படுகிறது:
| கூறுகள் | N பரிமாறுதல் (25µl அமைப்பு) |
| nCOV ப்ரைமர் TaqMan ஆய்வு கலவை | 18 μl × N |
| RT-PCR எதிர்வினை தீர்வு | 2 μl × N |
| *N = சோதிக்கப்பட்ட மாதிரிகளின் எண்ணிக்கை + 1 (எதிர்மறை கட்டுப்பாடு) + 1 (nCOV)நேர்மறை கட்டுப்பாடு) | |
2.2 கூறுகளை நன்கு கலந்த பிறகு, குழாய் சுவரில் உள்ள அனைத்து திரவமும் குழாயின் அடிப்பகுதியில் விழ சிறிது நேரம் மையவிலக்கு செய்யவும், பின்னர் 20 µl பெருக்க அமைப்பை PCR குழாயில் சேர்க்கவும்.
3 மாதிரி எடுத்தல் (மாதிரி தயாரிப்பு பகுதி)
பிரித்தெடுத்த பிறகு 5μl எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடுகளைச் சேர்க்கவும். சோதிக்கப்பட வேண்டிய மாதிரியின் RNA PCR எதிர்வினைக் குழாயில் சேர்க்கப்படுகிறது.
பெருக்கக் கண்டறிதல் பகுதிக்கு மாற்றுவதற்கு முன், குழாயை இறுக்கமாக மூடி, 8,000 rpm இல் சில வினாடிகள் மையவிலக்கு விசையை இயக்கவும்.
4 PCR பெருக்கம் (பெருக்கப்பட்ட கண்டறிதல் பகுதி)
4.1 கருவியின் மாதிரி கலத்தில் எதிர்வினை குழாயை வைத்து, அளவுருக்களை பின்வருமாறு அமைக்கவும்:
| மேடை | மிதிவண்டி எண் | வெப்பநிலை(°C) | நேரம் | சேகரிப்புதளம் |
| தலைகீழ்படியெடுத்தல் | 1 | 42 | 10நிமி | - |
| முன்-பணிநீக்கம்n | 1 | 95 | 1நிமி | - |
| மிதிவண்டி | 45 | 95 | 15கள் | - |
| 60 | 30கள் | தரவு சேகரிப்பு |
கருவி கண்டறிதல் சேனல் தேர்வு: ஃப்ளோரசன்ஸ் சிக்னலுக்கான FAM、HEX、CY5 சேனலைத் தேர்ந்தெடுக்கவும். குறிப்பு ஃப்ளோரசன்ட் NONE க்கு, தயவுசெய்து ROX ஐத் தேர்ந்தெடுக்க வேண்டாம்.
5 முடிவு பகுப்பாய்வு (அமைப்பதற்கு ஒவ்வொரு கருவியின் பரிசோதனை வழிமுறைகளையும் பார்க்கவும்)
எதிர்வினைக்குப் பிறகு, முடிவுகளைச் சேமிக்கவும். பகுப்பாய்விற்குப் பிறகு, படத்தின் படி அடிப்படை மதிப்பு, முடிவு மதிப்பு மற்றும் வரம்பு மதிப்பை சரிசெய்யவும் (பயனர் உண்மையான சூழ்நிலைக்கு ஏற்ப சரிசெய்யலாம், தொடக்க மதிப்பை 3~15 ஆக அமைக்கலாம், முடிவு மதிப்பை 5~20 ஆக அமைக்கலாம், சரிசெய்தல்) மடக்கை வரைபடத்தில் சாளரத்தின் வாசலில், வரம்பு கோடு மடக்கை கட்டத்தில் உள்ளது, மேலும் எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டின் பெருக்க வளைவு ஒரு நேர் கோடு அல்லது வரம்பு கோட்டிற்கு கீழே உள்ளது).
6 Quauty கட்டுப்பாடு (சோதனையில் ஒரு நடைமுறை கட்டுப்பாடு சேர்க்கப்பட்டுள்ளது) எதிர்மறை கட்டுப்பாடு: FAM, HEX, CY5 கண்டறிதல் சேனல்களுக்கு வெளிப்படையான பெருக்க வளைவு இல்லை.
COV நேர்மறை கட்டுப்பாடு: FAM மற்றும் HEX கண்டறிதல் சேனல்களின் வெளிப்படையான பெருக்க வளைவு, Ct மதிப்பு≤32, ஆனால் CY5 சேனலின் பெருக்க வளைவு இல்லை;
மேலே உள்ள தேவைகள் ஒரே பரிசோதனையில் ஒரே நேரத்தில் பூர்த்தி செய்யப்பட வேண்டும்; இல்லையெனில், சோதனை செல்லாது மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட வேண்டும்.
7 முடிவுகளை தீர்மானித்தல்.
7.1 சோதனை மாதிரியின் FAM மற்றும் HEX சேனல்களில் பெருக்க வளைவு அல்லது Ct மதிப்பு> 40 இல்லை என்றால், மேலும் CY5 சேனலில் பெருக்க வளைவு இருந்தால், மாதிரியில் 2019 புதிய கொரோனா வைரஸ் (2019-nCoV) RNA இல்லை என்று தீர்மானிக்க முடியும்;
.2 சோதனை மாதிரியில் FAM மற்றும் HEX சேனல்களில் வெளிப்படையான பெருக்க வளைவுகள் இருந்தால், மேலும் Ct மதிப்பு ≤40 ஆக இருந்தால், அந்த மாதிரி 2019 புதிய கொரோனா வைரஸுக்கு (2019-nCoV) நேர்மறையானது என்று தீர்மானிக்க முடியும்.
7.3 சோதனை மாதிரியில் FAM அல்லது HEX இன் ஒரு சேனலில் மட்டுமே தெளிவான பெருக்க வளைவு இருந்தால், Ct மதிப்பு ≤40 ஆக இருந்தால், மற்ற சேனலில் பெருக்க வளைவு இல்லை என்றால், முடிவுகளை மீண்டும் சோதிக்க வேண்டும். மறுபரிசீலனை முடிவுகள் சீரானதாக இருந்தால், மாதிரி புதியவற்றுக்கு நேர்மறையாக இருக்கும் என்று தீர்மானிக்க முடியும்.
கொரோனா வைரஸ் 2019 (2019-nCoV). மறுபரிசீலனை முடிவு எதிர்மறையாக இருந்தால், 2019 புதிய கொரோனா வைரஸுக்கு (2019-nCoV) மாதிரி எதிர்மறையாக உள்ளது என்று தீர்மானிக்க முடியும்.
நேர்மறை தீர்ப்பு மதிப்பு
கருவித்தொகுப்பின் குறிப்பு CT மதிப்பை தீர்மானிக்க ROC வளைவு முறை பயன்படுத்தப்படுகிறது மற்றும் உள் கட்டுப்பாட்டு குறிப்பு மதிப்பு 40 ஆகும்.
சோதனை முடிவுகளின் விளக்கம்
1. ஒவ்வொரு பரிசோதனையும் எதிர்மறை மற்றும் நேர்மறை கட்டுப்பாடுகளுக்காக சோதிக்கப்பட வேண்டும். கட்டுப்பாடுகள் தரக் கட்டுப்பாட்டுத் தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்யும்போது மட்டுமே சோதனை முடிவுகளைத் தீர்மானிக்க முடியும்.
2.FAM மற்றும் HEX கண்டறிதல் சேனல்கள் நேர்மறையாக இருக்கும்போது, CY5 சேனலின் (உள் கட்டுப்பாட்டு சேனல்) முடிவு கணினி போட்டி காரணமாக எதிர்மறையாக இருக்கலாம்.
3. உள் கட்டுப்பாட்டு முடிவு எதிர்மறையாக இருக்கும்போது, சோதனைக் குழாயின் FAM மற்றும் HEX கண்டறிதல் சேனல்களும் எதிர்மறையாக இருந்தால், , அமைப்பு முடக்கப்பட்டுள்ளது அல்லது செயல்பாடு தவறாக உள்ளது, சோதனை செல்லாது என்று அர்த்தம். எனவே, மாதிரிகளை மீண்டும் சோதிக்க வேண்டும்.
